什么？知名國民零食品牌被爆成分摻假？超市暢銷面包品牌被爆霉菌超標(biāo)？肉制品頻繁被爆“掛驢頭賣狗肉”的現(xiàn)象？近期食品安全問題引發(fā)眾議，食品安全問題有無解決之法？
食品安全是全民關(guān)注的重點(diǎn)，我國對(duì)食品安全高度重視，加大了對(duì)食品生產(chǎn)、加工、流通和銷售等各個(gè)環(huán)節(jié)的管理和監(jiān)控，但食源性致病菌引發(fā)的食物中毒、食物摻假售假、違規(guī)使用轉(zhuǎn)基因生物等事件仍頻繁發(fā)生，開發(fā)高效的食品安全檢測(cè)方法迫在眉睫。
數(shù)字PCR之食品檢測(cè)
數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（digital polymerase chain reaction，dPCR）是一種新型核酸擴(kuò)增技術(shù)，無需借助內(nèi)參基因和標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過極限稀釋和泊松分布統(tǒng)計(jì)即可實(shí)現(xiàn)核酸單分子層面的**定量分析，具有高靈敏度、高**度和高耐受性等技術(shù)優(yōu)勢(shì)，在食品安全核酸檢測(cè)領(lǐng)域具有極大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>
基于數(shù)字PCR技術(shù)，建立了在食源性致病微生物檢測(cè)（大腸桿菌、沙門氏菌、李斯特菌 、金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌、蠟樣芽胞桿菌、阪崎腸桿菌、志賀氏菌、椰毒假單胞菌、空腸彎曲菌），針對(duì)存在摻假問題的動(dòng)物源性成分（豬、牛、火雞、駱駝、狐）、植物源性成分（馬鈴薯、紅薯、木薯、蓮子、蕓豆、芝麻、花生、赤小豆、紅豆、板栗、綠豆）的定性和定量檢測(cè)方法，以及在轉(zhuǎn)基因成分鑒定、DNA殘留檢測(cè)、飲用水檢測(cè)等方向也開展了dPCR的方法學(xué)建立。
接下來，我們根據(jù)近年來的成果，來展示下dPCR在食品安全方面如何大展拳腳。
案例1 使用dPCR對(duì)肉類和肉制品進(jìn)行物種鑒定和定量
德國科學(xué)家采用了數(shù)字PCR對(duì)不同肉類及肉制品中的成分進(jìn)行了定量分析，結(jié)果顯示dPCR相比于傳統(tǒng)的qPCR，其LOD和LOQ分別能達(dá)到0.01%和0.001%的水平，優(yōu)于qPCR的表現(xiàn)，并且在14個(gè)不同的物種中確認(rèn)了檢測(cè)體系的特異性。
案例2 dPCR定量檢測(cè)包裝飲用水中銅綠假單胞菌
食品質(zhì)量監(jiān)管檢測(cè)部門研究開發(fā)了一種基于數(shù)字PCR技術(shù)的檢測(cè)體系，應(yīng)用于定量檢測(cè)包裝飲用水中銅綠假單胞菌的技術(shù)。根據(jù)銅綠假單胞菌外毒素A（ETA）基因序列合成特異性引物和探針，通過多種菌株擴(kuò)增驗(yàn)證方法特異性，通過人工添加銅綠假單胞菌驗(yàn)證方法檢出限。
結(jié)果表明，建立的包裝飲用水中銅綠假單胞菌 ddPCR 定量檢測(cè)方法特異性強(qiáng)，檢出限為 10 CFU/mL，靈敏度高，適用性好。該方法可以滿足包裝飲用水中銅綠假單胞菌定量檢測(cè)需求，為包裝飲用水生產(chǎn)企業(yè)銅綠假單胞菌污染控制和市場(chǎng)監(jiān)管提供技術(shù)支撐，保護(hù)消費(fèi)者的飲水安全和生命健康。
圖 1 引物探針特異性驗(yàn)證結(jié)果
A05~H09 為 24 株待測(cè)試菌株，其中 E09 為 CICC 24649，F(xiàn)09 為 ATCC 27853，G09為 CMCC 10901，H09為 CICC 24647，均為銅綠假單胞菌。
圖 2 ddPCR檢測(cè)銅綠假單胞菌靈敏度結(jié)果
A、B、C、D、E、F、G、H依次為銅綠假單胞菌含量 106 、105 、104 、103 、102 、 10、1、0.1 CFU/mL
案例3 基于PacBio SMRT與dPCR聯(lián)用技術(shù)的嬰幼兒配方奶粉微生物安全性評(píng)價(jià)
嬰幼兒配方奶粉中的大量細(xì)菌已被滅活，然而滅活微生物仍影響產(chǎn)品品質(zhì)和貨架期?，F(xiàn)采集6份嬰幼兒配方奶粉，使用細(xì)菌純培養(yǎng)、單分子實(shí)時(shí)測(cè)序技術(shù)PacBio SMRT和dPCR聯(lián)用技術(shù)對(duì)其污染微生物組成進(jìn)行評(píng)價(jià)。
采用純培養(yǎng)技術(shù)在樣品中均未檢測(cè)到大腸菌群、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、阪崎腸桿菌和芽孢。使用PacBio SMRT 測(cè)序技術(shù)，在嬰幼兒配方奶粉中共鑒定出 14個(gè)細(xì)菌門、138個(gè)細(xì)菌屬和255個(gè)細(xì)菌種。其中6份樣品均存在過嗜冷菌蠟樣芽孢桿菌，其平均相對(duì)含量高達(dá)23.54%，這一滅活的細(xì)菌也會(huì)影響產(chǎn)品貨架期。此外，采用PacBio SMRT測(cè)序技術(shù)，該研究僅發(fā)現(xiàn)IF3、IF4、IF5、IF6樣品中存在相對(duì)含量較低的大腸桿菌。然而，采用dPCR對(duì)大腸桿菌進(jìn)行**定量檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)6份樣品中均存在大腸桿菌的16 rRNA基因。
圖3 蠟樣芽孢桿菌 (a)和大腸桿菌(b)定量結(jié)果
Fig.3Quantitative results of Bacillus cereus (a) and Escherichia coli (b)
