核酸是一種生物分子，包括DNA和RNA，是生命體內(nèi)儲存和傳遞遺傳信息的基本分子。DNA主要集中在細胞核、線粒體和葉綠體中，而RNA則主要分布在細胞質(zhì)中。核酸提取是指從復(fù)雜體系中實現(xiàn)核酸的分離和純化，以便進行相應(yīng)的科學(xué)研究和實際應(yīng)用。 核酸提取純化原則 1、保證核酸一級結(jié)構(gòu)的完整性； 2、排除其它核酸分子的污染（如提取DNA時排除RNA的干擾）； 3、核酸樣品中不存在對酶有抑制作用的有機溶劑和過高濃度的金屬離子； 4、盡可能降低其它生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子的污染。 核酸提取基本步驟 1、裂解細胞，釋放核酸：使用裂解液破壞樣品細胞結(jié)構(gòu)，從而使樣品中的核酸游離在體系中； 2、核酸的分離與純化：將與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)以及多糖、脂類等生物大分子和其他不需要的核酸分子去除； 3、核酸富集與洗脫：采用洗脫液處理吸附有核酸的吸附物，富集得到目的核酸。 常用核酸提取方法 1、溶液法 是比較經(jīng)典的提取方法，苯酚是蛋白質(zhì)的變性劑，反復(fù)抽提，使蛋白質(zhì)變性，SDS將細胞膜裂解，在蛋白酶K、EDTA的存在下消化蛋白質(zhì)或多肽或小肽分子，變性降解核蛋白，使DNA從核蛋白中游離出來。而DNA易溶于水，不溶于有機溶劑。蛋白質(zhì)分子表面帶有親水基團，也容易進行水合作用，并在表面形成一層水化層，使蛋白質(zhì)分子能順利地進入到水溶液中形成穩(wěn)定的膠體溶液。當有機溶液存在時，蛋白質(zhì)的這種膠體穩(wěn)定性遭到破壞，變性沉淀。離心后有機溶劑在試管底層(有機相)，DNA存在于上層水相中，蛋白質(zhì)則沉淀于兩相之間。離心分層后取水層，經(jīng)過多次重復(fù)操作，并合并含核酸的水相，利用核酸不溶于醇的性質(zhì)，用乙醇/異丙醇來沉淀核酸，然后再進行分離和純化、溶解后即可得到高純度核酸。 溶液法成本低，但存在有毒試劑，影響操作人員健康，而且較為繁瑣，操作時間長，提取的核酸質(zhì)量也較為一般。 2、柱提法 利用特殊硅基質(zhì)吸附材料，能夠特定吸附核酸，而蛋白質(zhì)、多糖、脂類等基本不吸附，被離心沉淀與核酸分離的原理。硅膠膜表面存在的硅醇基團呈弱酸性，水化后帶負電。樣品裂解后，如果溶液中存在一定濃度的陽離子時，會中和DNA硅醇基團之間的表面負電荷，從而使DNA能夠牢固地吸附在硅膠膜表面。而當處于低鹽水溶液時，DNA磷酸基團和硅膠膜的硅醇基團之間存在排斥，硅膠膜就會把DNA釋放出來，從而達到分離純化核酸的目的。 柱提法試劑盒價格較低，操作相對簡單，在市面上應(yīng)用較為廣泛。但是其對樣本起始量會有一定的限制，當投入樣本過多（如大塊組織）可能導(dǎo)致吸附膜堵塞，同時由于需要反復(fù)離心不便于高通量、自動化操作等。 3、磁珠法 與硅基離心柱原理類似，磁性顆?；钚曰鶊F在一定條件下可與核酸特異性結(jié)合和解離，先使用細胞裂解液裂解細胞，核酸帶負電的磷酸基團借由解離的鹽離子（如Na+）與磁珠表面羧基形成離子橋，使DNA被特異性吸附到羧基磁珠表面，利用磁珠的磁性，可通過外加磁場進行收集洗脫，獲得質(zhì)量較好的核酸模板。 磁珠法不需要離心、無需加入多種試劑，操作簡單，符合核酸自動化提取要求，但是成本較高。 蛋白酶K在核酸提取中的作用 蛋白酶K是一種從白色念珠菌分離出來的強力蛋白溶解酶，具有很高的比活性。蛋白酶K能降解與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)，分離DNA與蛋白質(zhì)，使DNA能夠更好被提取。還可降解RNA水解酶（RNase）活性，抑制RNase水解模板的RNA，在RNA的提取和檢測過程中起到不可或缺的作用。而RNA極不穩(wěn)定、易于被廣泛存在的RNase降解，因此利用蛋白酶創(chuàng)造一個無RNase的環(huán)境、嚴格防止RNase污染是成功提取RNA的關(guān)鍵。 核酸提取的下游應(yīng)用包括 1、PCR擴增：從提取的DNA或RNA中擴增目的片段，用于分子診斷、分子生物學(xué)研究、藥物研發(fā)、病毒檢測等。 2、實時熒光定量PCR：用于定量檢測DNA或RNA的含量，可以用于基因型檢測、差異表達分析、細胞數(shù)量、病毒載量、轉(zhuǎn)基因生物檢測等。 3、基因測序：對提取的DNA或RNA進行測序，用于腫瘤基因組學(xué)、新生兒篩查、精準醫(yī)學(xué)和基因診斷等。 4、蛋白質(zhì)研究：用提取的DNA或RNA表達翻譯合成蛋白質(zhì)，用于研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能等。 這些下游應(yīng)用可以幫助我們更深入地研究生物樣本中的DNA或RNA，并揭示它們在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域中的重要作用。 沃森生物試劑推薦
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